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单细胞转录组测序

上市日期:2021-02-24

简介:10x Genomics 是基于微流控技术的单细胞系统,可同时获得100-800000个细胞的表达信息,实现对细胞群体的划分与细胞群体间基因表达差异的检测,是肿瘤细胞异质性、免疫细胞群体检测以及胚胎发育研究的黄金方法。10xGenomics单细胞应用广泛,可应用的细胞类型有:生殖细胞,胚胎细胞,神经细胞,免疫细胞,肿瘤细胞,干细胞,其他原代细胞。


1  实验流程

1.1实验流程图



单细胞转录组测序

1.2实验描述

1) 细胞质检RNA,用Countess®II Automated Cell Counter对细胞计数,将细胞浓度调整到理想浓度1×106/mL。

2) 10x 标记cDNA 片段,含有barcode信息的凝胶珠子首先与细胞和酶的混合物结合,然后被位于微流体'双十字'连接中的油表面活性剂液滴包裹。液滴非常小,仅能容纳一个凝胶珠子,液滴流到储液器中被收集后,凝胶珠子溶解释放引物序列,逆转录cDNA 片段,并以cDNA 为模板进行PCR 扩增。将每个液滴中含有barcode信息的产物混合,构建测序文库。

3) 建库,首先利用Biorupter 超声破碎仪将cDNA 打断成200~300bp左右的片段,加上测序接头P5 和测序引物R1 等传统二代测序的建库过程,最后进行PCR扩增得到DNA 文库。

4) 簇生成和测序,利用Qubit 仪器对文库进行定量,合格的文库被放置到cBot中进行桥式扩增,生成簇后利用Hiseq 或者Miseq测序仪进行测序。原理是每个循环都加入A,T,G,C 4 种荧光基团标记的dNTP,依据AT、GC 配对,对应的dNTP通过1DNA 聚合酶结合到模板DNA 链上,其他未结合的dNTP被洗脱掉,结合的位置释放出荧光信号,被计算机捕捉到并进行相应转换,从而得到该位置的碱基信息。

 

 


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