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小鼠生化位点检测

日期: 2019-07-30
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一、实验器材

1.样品

(1)血清:用于Es-1和Trf两位点检查。

(2)溶血清:用于检查Hbb、Car-2和Ldr-1位点。

(3)肾匀浆:用于检查Es-2、Es-3、Idh-1、Mod-1、Akp-1、Pgm-1、Pep-1、Gpd-1、Gpi-1、Ce-2位点。

(4)尿液:一般在早上8~9时取鼠原尿,做一倍稀释后方可使用,用于Mup-1位点的检查。

2.缓冲液:略。

3.染色液:略。

4.点样品一套,电泳仪一台,电泳槽一个,乙酸纤维薄膜若干张。

5.滴管、管架、直径10cm培养皿、普通滤纸、烧杯各二个。


二、实验方法和步骤

1.实验方法

我们采用的是水平乙酸纤维薄膜电泳法即用普通滤纸做盐桥,在低温常压下的电泳。


2.实验步骤

(1)把电泳缓冲液加入电泳槽内到红线位置,盐桥滤纸对折后用订书机将其同定在桥架上,然后加盖置于4℃冰箱或相应冷室里预冷。

(2)从低温(-20℃)冰箱中取出样品,于室温下自然解冻,并同时将乙酸纤维薄膜裁成适当大小投入缓冲液中浸泡湿透。

(3)从缓冲液中取出乙酸纤维薄膜夹于两张普通滤纸间,用手轻压滤纸,以吸去薄膜上的多余缓冲液。

(4)样品解冻后,用弯头滴管吸取少量样品液于点样板上的小方格内,并依序记下样品号码,再用点样刷蘸取适量样品液点在乙酸纤维薄膜粗糙面距边缘1.5cm处,之后迅速转入电泳槽内,按规定方向(缓冲液pH值大于5.6的,样品的电泳方向是由负极向正极泳动,若pH值小于或等于5.6则由正极向负极泳动)把点上样的薄膜水平搭在盐桥上,待调整好位置后加盖饱和1~2min,接通电泳,选择适当电压和电流并按规定时间电泳。

(5)时间到后立即将电压电流选择调零和关掉电源,依次取出走完的乙酸纤维薄膜,放入相应的染色液中,染色5min后取出于5%乙酸溶液脱色1~2h,或直到电泳带背影完全清楚为止,自然风干后,照相或透明等处理,易于长期保存。


三、结果分析

结果分析指的是电泳带型的确定。我们知道,每个品系都有自己固定的电泳带型,这个原始的固定电泳带型称作该品系的标准型。品系间各位点的标准型有的相同,有的则不同;而品系间生化位点的标志相异对于电泳带型的确定是很有用的。在实际工作中,由于DBA/2和C57BL两品系小鼠的多数生化位点标志都不相同,故在生化位点检查时将其用作确定待知鼠电泳带型的参照物来使用。

一般在电泳时,总是把待测样品和已知标准型样品在同样条件和同一支持物上走电泳的,这样待测作品就可与标准型样品的带型进行对比了,以此即可确定待测样品的带型。例如我们把特测样品和已知标准的DBA/2和C57BL品系的样品同时走Car-2电泳,其待测带型如果跟DBA/2一样则为b型,若和C57BL的一样就是a型,要是即同DBA/2,又同C57BL,那么它就是混杂带型。

注意:对于一个单位来讲,第一次检查应该是全面的,特别是新引进的或新培育的品系更应如此。但如果这个单位已进行过一次全面检测后,隔一段时间。要对已查过的品系进行再复查时,若做生化位点检测,可只测临界位点,即Car-2、MuP-1、Hbb、Es-1、Trf和Es-3。这样可节省人力和物力。

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