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细胞培养好,细胞实验难不倒!

日期: 2018-07-02
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细胞实验污染防控

细胞培养最基本的是做好污染防控,包括微生物污染的防控和细胞系间交叉污染的防控。

实验中需保持良好的操作习惯,所用材料的位置摆放要顺手,污染源和已灭菌物品要分开放置。实验室也需定期清洁与消毒。


细胞实验血清与培养基

通常血清的添加比例为10%,当然也可根据细胞状态和生长速率适当增加或减少添加比例。在更换血清品牌或者批次时,最好需对血清的品质进行验证,防止对实验造成影响。

对于培养基,目前商品化的比较成熟,稳定性也较好。如若需自配培养基时,过滤前搅拌时间不宜过长(培养基中营养丰富,细菌常温下20min就可繁殖一代,其代谢产物会对培养基的品质产生影响)。培养基过滤除菌后,应对培养基进行无菌验证,防止污染。


细胞实验培养瓶

目前商品化的细胞培养瓶主要为瓶盖是否带气孔两种。其中不带透气孔细胞培养瓶拧紧后需适当回旋瓶盖,保证CO2能顺利进入细胞培养瓶。

细胞培养过程中,对于适应能力强的肿瘤细胞,可在传代3-4次后更换新的细胞培养瓶。对于非肿瘤细胞系如293T,HEK293等细胞,建议每次传代更换新的细胞培养瓶来保证细胞状态。


细胞实验传代

正常细胞形态较好,轮廓清晰,边缘透亮,细胞增殖状况良好。当贴壁细胞长到密度90%时,需进行传代。

传代时通常使用胰酶消化法。该方法又分为干消化法和湿消化法。

干消化法:胰酶浸润后弃去胰酶,待细胞变圆后加入新鲜培养基吹下后再进行细胞传代。

湿消化法:待细胞变圆,肉眼观察下成流沙状脱落时即可加入新鲜培养基终止消化,1000rpm离心5min,弃去上清,用新鲜培养基重悬传代。

吹打细胞时,手法要轻柔,避免吹打出气泡,造成细胞因内外压差破裂,同时需避免刮到瓶壁影响细胞的贴壁。

不同细胞的贴壁能力不同,消化时间不同;不同细胞细胞间连接强度不一样,消化时间不同;同一细胞生长状状况不同,消化时间不同。消化时适时观察细胞形态,避免因过度消化影响细胞活性。

传代间隔时间和传代比例因细胞而异。细胞传代过程中,当细胞出现状态不好或者污染时及时弃去细胞,重新复苏。


细胞实验冻存与复苏

当细胞生长状况较好或者代数较早时,需及时大量的冻存。

细胞冻存液比例为培养基:血清:DMSO=7:2:1,也可血清:DMSO=9:1。细胞冻存密度通常为1-3×106个/ml。细胞冻存采用慢冻方式,减少冰晶形成,避免细胞损伤。通常4℃放置0.5 h,-20℃放置2 h,-80℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内。

细胞复苏时升温要快,防止在解冻过程中水分进入细胞,形成冰晶,影响细胞存活。38℃水浴不时摇动,在1分钟内使其完全融化,1000rpm离心5min,弃去上清,用新鲜培养基重悬移入培养瓶中。


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