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研究蛋白质组常用的方法

日期: 2017-07-14
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双向凝胶电泳  双向凝胶电泳的原理,第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离,第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离,把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。由于双向电泳技术在蛋白质组与医学研究中所处的重要位置,它可用于蛋白质转录及转录后修饰研究,蛋白质组的比较和蛋白质间的相互作用,细胞分化凋亡研究,致病机制及耐药机制的研究,疗效监测,新药开发,癌症研究,蛋白纯度检查,小量蛋白纯化,新替代疫苗的研制等许多方面。近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。    

等电聚焦   等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。等电聚焦凝胶电泳依据蛋白质分子的静电荷或等电点进行分离,等电聚焦中,蛋白质分子在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳。载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧酸,在电场中形成正极为酸性,负极为碱性的连续的pH梯度。蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下带有电荷,因此可以在电场中移动;当蛋白质迁移至其等电点位置时,其静电荷数为零,在电场中不再移动,据此将蛋白质分离。    

生物质谱   生物质谱技术是蛋白质组学研究中最重要的鉴定技术,其基本原理是样品分子离子化后,根据不同离子之间的荷质比(M/E)的差异来分离并确定分子量。对于经过双向电泳分离后的目标蛋白质用胰蛋白酶酶解(水解Lys或Arg的-C端形成的肽键)成肽段,再对这些肽段用质谱进行鉴定与分析。目前常用的质谱有两种:基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾质谱(ESI- MS)。    

飞行时间质谱   MALDI 的电离方式是 Karas和Hillenkamp于1988年提出。MALDI的基本原理是将分析物分散在基质分子(尼古丁酸及其同系物)中并形成晶体,当用激光(337nm的氮激光)照射晶体时,基质分子吸收激光能量,样品解吸附,基质-样品之间发生电荷转移使样品分子发生电离。它从固相标本中产生离子,并在飞行管中测定出其分子量,MALDI-TOF-MS一般用于肽质量指纹图谱,非常快速(每次分析只需3~5min),灵敏(达到fmol水平),可以精确测量肽段质量,但是如果在分析前不修饰肽段,MALDI-TOF-MS不能给出肽片段的序列。    

电喷雾质谱(ESI-MS)   ESI- MS是利用高电场使质谱进样端的毛细管柱流出的液滴带电,在N2气流的作用下,液滴溶剂蒸发,表面积缩小,表面电荷密度不断增加,直至产生的库仑力与液滴表面张力达到雷利极限,液滴爆裂为带电的子液滴,这一过程不断重复使最终的液滴非常细小呈喷雾状,这时液滴表面的电场非常强大,使分析物离子化并以带单电荷或多电荷的离子形式进入质量分析器。ESI-MS从液相中产生离子,一般说来,肽段的混合物经过液相色谱分离后,经过偶联的与在线连接的离子阱质谱分析,给出肽片段的精确的氨基酸序列,但是 分析时间一般较长。

  

目前,许多实验室两种质谱方法联用,得以获得有意义的蛋白质的肽段序列,进而设计探针或引物来获得有意义的基因。随着对蛋白质组研究的深入,又有多种新型的质谱仪陆续出现,主要是在上述质谱仪的基础上进行的改进和重新组合。

 

 

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