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TUNEL检测

日期: 2017-06-21
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在细胞凋亡过程中中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂都会产生大量的粘性3'-OH末端,在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,可将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端,通过这种方法可进行对凋亡细胞的检测,我们称这类方法为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。由于正常的或正在增殖的细胞几乎不存在DNA双链或单链的断裂,因而极少有3'-OH的存在,所以很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。TUNEL法原位标记凋亡检测试剂盒

细胞发生凋亡以后,出现多个生物学改变特征,如:细胞膜、染色质凝集、核DNA断裂等等。目前DNA断裂检测是一种被广为认可的检测细胞凋亡的方法,这种检测可以通过提取细胞DNA进行凝胶电泳来完成,也可以进行原位检测。

TUNEL方法的基本原理如下:在TdT酶作用下,将生物素或者溴标记的核苷酸连接到细胞内断裂DNA游离的3'-OH上,然后加入酶标的链霉亲和素或者抗标记核苷酸的抗体,达到原位检测目的。

试剂盒简单操作步骤:

1.细胞或组织片固定(中性固定液,如3.7%甲醛);

2.水化(样本依次在100%、95%、70%的乙醇处理);

3.PBS浸泡;

4.蛋白酶K处理标本(蛋白酶K主要应用于组织样本和对照片,Cytonin用于新鲜准备的细胞样本);

5.双蒸水(dH2O)洗涤;

6.3%H2O2甲醇溶液(Quenching solution)消除内源性HRP;

7.PBS中洗涤;

8.1XTdT标记缓冲液孵育;

9.TdT标记Biotin-dNTP(TdT标记反应混合物);

10.终止标记反应(1XTdT Stop Buffer);

11.PBS洗涤;

12.Streptavidin-HRP孵育(若使用荧光标记的Streptavidin,则无需进行以下步骤,直接在荧光显微镜下观察);

13.PBS洗涤;

14.DAB溶液显色;

15.去离子水中洗涤;

16.甲基绿溶液复染

 

 

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