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Southern杂交原理

日期: 2017-06-14
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(一)所谓DNA探针,实际上是指利用一段已知序列的基因片段,与待测样品进行杂交。若靶基因和探针的核苷酸序列互补,就可以按碱基配对的原则进行核酸分子杂交,从而达到检测鉴定样品基因的目的。在随机引物法标记的反应液中,以随机合成的六聚核苷酸作为引物,dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物,单链DNA作为模板,在Klenow酶的作用下,合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后,再通过免疫反应进行检测。通过酶标记地高辛抗体检测,就可以肯定杂交反应存在。
免疫检验一般用碱性磷酸酶系统,BClP/NBT显色。敏感性很高。可用于膜上杂交和原位杂交。
(二)核酸探针膜上杂交原理
1、杂交总原则
单体脱氧核苷酸通过磷酸二酯键缩合成长链构成DNA一级结构。两条碱基互补的多核苷酸链按碱基配对原则形成双螺旋,构成DNA的二级结构。某些条件(如酸、碱,有机溶剂,加热,射线等)可使氢键断裂,DNA双链打开成单链重新结合。所谓杂交,是具有一定互补序列的核酸单链,DNA单链仍然可与序列同源的单链按碱基互补的原则结合成异源性双链结构的过程。
2、杂交膜的选择
Southern杂交所用的杂交膜可以选择硝酸纤维素膜和尼龙膜。硝酸纤维素膜的优点在于本底比较低,但只限于显色性检测,且不可重复杂交。尼龙膜分带正电的膜和不带电的膜两种。带正电的膜对核酸结合能力强,敏感性也较高。不带电的结合能力低。敏感性也差。尼龙膜的优点在于杂交用过的膜,用洗脱液(0.1xSSC,0.1%SDS)煮沸5-10min后去探针,可重复利用。若对杂交结果不满意,比如背景太深或显色不强,也可洗去探针之后重新杂交。
3、预杂交和杂交液
预杂交和杂交都使用相同的缓冲液,不同的仅是预杂交液中是不含探针的。下面是几种基本的杂交液配方:
(1)Standard buffer: 5Xssc,0.1%(w/v) N-Lauroylsarcosine,0.02%(w/v)SDS,1%
Blocking Reagent.
(2)Standard buffer+50% formamide:50% formamide(deionized),5Xssc,0.1%(W/V)
N-lauroy lsarcosine.0.02% (w/v)SDS,2%Blocking Reagent.
(3)High SDS buffer(church buffer): 7%SDS,50% formamide(deionized),
5Xssc, 2% Blocking Reagent,50Mm Sodium phosphate,0.1% N-Lauroylsarcosine.
4、Southern Blotting
DNA片段经电泳分离后按分子量的大小顺序排列在琼脂糖凝胶上。1975年Southern利用浓盐溶液的推动作用发明了将变性的单链DNA转移到硝酸纤维素膜上的方法,解决了原位转移的问题。Southern杂交虽然原理和操纵均很简单,但却是基因分析中必不可少的手段之一,在分子生物学研究中已经得到了广泛的应用。

 

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