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脂肪干细胞的培养,提取,鉴定技术及原理

日期: 2017-06-14
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  利用细胞培养技术、流式细胞术(体外扩增后脂肪干细胞ACSs的表型会发生改变,主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化),差异离心术(可将基质血管细胞沉淀并与悬浮的成熟脂肪细胞分离开来,沉淀中除了有脂肪干细胞ASCs,另外还存在部分血细胞、成纤维细胞和内皮细胞,基质血管细胞沉淀后可以接种到塑料培养瓶中,基质细胞可贴壁,造血和其他杂质细胞不贴壁,在随后的传代过程中将会被除去,最终得到的脂肪干细胞ASCs可再很长时间内保持摸分化状态)在体外分离原代细胞。
取C57BL/6 WT小鼠2只,常规麻醉消毒,取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状,用PBS液冲洗去麻药及血液,0.075%II型胶原酶消化(37℃,30分钟)以去除外基质,用生理盐水终止胶原酶的消化,离心(1 200 g,10分钟),弃上清液及未消化的脂肪,10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀,再用0.16 mol/L氯化氨溶解剩余的红细胞,离心洗涤,过200目铜网,得到单个核细胞。
镜下计数,按104个细胞/ml种植在培养瓶中,37℃ 5%CO2孵箱培养,24小时后第一次换液,之后3天换液一次,80%融合后用0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。显微镜下作形态学观察并选取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期以及细胞免疫表型(CD29/CD44)鉴定。


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