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细胞培养的冻存及复苏

日期: 2017-05-23
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细胞培养低温冻存是培养室常规工作和通用技术。细胞冻存在-196℃液氮中,储存时间几乎是无限的。细胞冻存及复苏的原则是慢冻快融。
1.冻存细胞
(1)选对数增生期细胞(证明无支原体污染),在冻存前1d换液。
(2)按常规方法把培养细胞制备成悬液,计数,使细胞密度达5×107/ml左右密度,离心,去上清。
(3)加入配制好的冻存液(培养液6.8ml,小牛血清2ml,DMSO 1ml,5.6%NaHCO3 0.1ml),按与去上清相同的量一滴一滴加入离心管中,然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。冻存细胞时培养液中加入保护剂10%二甲基亚砜(DMSO) 或甘油,可使冰点降低,使细胞内水分在冻结前透出细胞外。
(4)分装于无菌冻存管中,每管加1.5m悬液。
(5)旋好冻存管并仔细检查,一定要盖紧,做好标记。
(6)冻存:在特殊的仪器或简易的液氮容器中,按-1℃/min的速度,在30~40min时间内,下降到液氮表面,再停30min后,直接投入液氮中。要适当掌握下降冷冻速度,过快能影响细胞内水分透出,太慢则促进冰晶形成。
操作时应戴防护眼镜和手套,以免液氮冻伤。
2. 复苏细胞
(1)从罐中取出冻存管。
(2)迅速放入36℃~37℃水浴,不时摇动,使其急速融化,30~60s内完成。
(3)冻存管用70%酒精擦拭消毒后,打开盖子,用吸管将细胞悬液注入离心管中,再滴加10ml培养液。
(4)低速离心(500~1000r/min) 5min,去上清后再用培养液洗一次。
(5)用培养液适当稀释后,装入培养瓶37℃培养,次日更换一次培养液后,继续培养。以后仍按常规进行细胞培养
冻存细胞数量要充分,密度应达到107/ml,在融后稀释20倍时,仍能保持5×105/

 

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