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1.长时间水浴解冻因为原代细胞非常容易受到解冻过程的影响,所以在37℃水浴锅中解冻时,要在水中摆动溶解。在细胞半溶后(不要等到全部溶解),迅速拿到生物安全柜或超净台中,用1ml的枪,抽出事先准备好的培养基打入冻存管中,然后抽到培养瓶中,反复进行,直至溶解。2.把冻存管的细胞溶解后迅速离心如果原代细胞溶解后马上离心,细胞所受的打击可能比DMSO的毒性还要大,不建议采用这个方法。用带有血清的培养基溶解后铺瓶,第二天换液去除DMSO。3.让原代细胞长满()瓶(皿、板)原代细胞长满后,细胞会出现老化。因为原代细胞不是的细胞团,把混入的细胞控制在小限度非常重要。建议细胞长到90-95%进行传代。4.传代时用大量的胰蛋白酶处理原代细胞传代时,要用低浓度的胰蛋白酶消化,在显微镜下看到细胞开始变圆、脱落后迅速终止胰蛋白酶。建议采用含10%血清的培养基终止或大豆由来的蛋白酶终止剂终止。5.细胞培养后再冻存原代细胞再冻存后,细胞会老化、也可能引起机能变化,所以不建议再冻存。细胞再冻存也是细胞死伤的主要原因。6.原代细胞无限增殖原代细胞和细胞系不同,增殖能力是有限的。为了防止遗传上的变化,可以尽快开始做实验。另外,为了防止混入杂细胞比例的增加,要经常观察细胞形态。课题设计、基金申请、文章润色、实验外包 基尔顿生物欢迎您的咨询!
发布时间: 2018 - 11 - 08
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1、细菌:识别:细菌在显微镜下为黑色细沙状,根据感染细菌的不同,可有不同的外形,有球形,链形,杆形等。大家不必深究。只要发现培养液浑浊变黄,培养瓶顶部有一层细沙一样的东西。就知道大事不好啦。见下图。处理:可在培养液中加相应的抗生素处理。可以用四环素,庆大霉素,或者链霉素,前两者的工作浓度是50 μg/mL;链霉素的工作浓度是100 μg/mL。其实,毛毛虫说句实话,一旦发生污染,就已经大势已去了。如果细胞不是特别特别珍贵的话,还是趁早扔了,重起炉灶吧。所以,重要的还是防范于未然。做好培养间,CO2孵箱,器皿和培养液的消毒灭菌工作。在操作的时候,严格执行无菌操作规范。2、霉菌识别:因为培养液是清亮的,所以霉菌污染非常难以早期发现,等发现时往往已经为时过晚了。培养液中慢慢地出现絮状杂质,镜下可见呈细丝状的团状漂浮物,如同风中柳絮。细胞仍可生长,但时间一长,细胞的状态就变差。见下图。处理:细胞一旦被霉菌污染,很难挽救,两性霉素B或制霉菌素都于事无补,建议果断舍弃该污染细胞,将环境消毒。采用酒精底地擦洗一遍CO2孵箱。然后再用新洁尔灭擦洗一遍。把水盘里加上饱和量的硫酸铜。3、支原体:识别:多为多边形,培养液一般会变浑浊。支原体感染细胞以后,细胞病变不很明显,只是和你一起慢慢变老。支原体污染后,可影响的细胞生长参数。故进行实验前,确认细胞为mycoplasma-free,实验结果之数据方有意...
发布时间: 2018 - 11 - 07
浏览次数:35
1.收到细胞,时间要镜检:观察细胞形态是否正常,对于贴壁细胞则要注意看贴壁情况是否很好,观察细胞密度,有疑议及时咨提供细胞的技术人员。 由于运输的时间或者温度的变化,很多贴壁细胞在盛满培养基的瓶子里生长的状态和平时会有点不一样,主要是贴壁牢固问题。比如293T,平时贴壁就不是很牢,在装满的培养基瓶子里面,会发生大片的脱落,细胞聚集在一起,但是细胞生长还是正常的,通过离心收集,加以胰酶的消化,重新打散,又可以正常的贴壁生长。2.当通过上一步的观察,细胞初步没有问题时,进行下一步操作。当收到的细胞密达到80%左右时,则处理如下:弃除瓶中大部分培养基,仅保留5到10mL培养所需的常规培养基;或更换新鲜的培养基,置于培养箱中,随后每天观察。 细胞在低于正常生长温度情况下,会调整为静止期,或者慢速生长期,恢复37度的环境至少3个小时左右,才能重新调整到接近对数生长期的状态,在对数生长期进行细胞的传代会大大增加传代的成功率,和细胞的存活率。3.如果经步观察发现细胞密度超过90%,并且细胞状态很好时,则复温后2个小时需要立即传代。传代的比例应依据不同的细胞而定。对于生长比较快,状态稳定,不易受外界影响的细胞可以一次多传几瓶;对于生长较慢,细胞比较薄,状态容易波动的细胞类型,一次少传些,每瓶细胞密度大些,便于稳定生长。至于一些比较陌生的细胞,次处理也可以依照第二种情况。   &...
发布时间: 2018 - 11 - 05
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