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(一)所谓DNA探针,实际上是指利用一段已知序列的基因片段,与待测样品进行杂交。若靶基因和探针的核苷酸序列互补,就可以按碱基配对的原则进行核酸分子杂交,从而达到检测鉴定样品基因的目的。在随机引物法标记的反应液中,以随机合成的六聚核苷酸作为引物,dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物,单链DNA作为模板,在Klenow酶的作用下,合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后,再通过免疫反应进行检测。通过酶标记地高辛抗体检测,就可以肯定杂交反应存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统,BClP/NBT显色。敏感性很高。可用于膜上杂交和原位杂交。(二)核酸探针膜上杂交原理1、杂交总原则单体脱氧核苷酸通过磷酸二酯键缩合成长链构成DNA一级结构。两条碱基互补的多核苷酸链按碱基配对原则形成双螺旋,构成DNA的二级结构。某些条件(如酸、碱,有机溶剂,加热,射线等)可使氢键断裂,DNA双链打开成单链重新结合。所谓杂交,是具有一定互补序列的核酸单链,DNA单链仍然可与序列同源的单链按碱基互补的原则结合成异源性双链结构的过程。2、杂交膜的选择Southern杂交所用的杂交膜可以选择硝酸纤维素膜和尼龙膜。硝酸纤维素膜的优点在于本底比较低,但只限于显色性检测,且不可重复杂交。尼龙膜分带正电的膜和不带电的膜两种。带正电的膜对核酸结合能力强,敏感性也较高。不...
发布时间: 2017 - 06 - 14
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利用细胞培养技术、流式细胞术(体外扩增后脂肪干细胞ACSs的表型会发生改变,主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化),差异离心术(可将基质血管细胞沉淀并与悬浮的成熟脂肪细胞分离开来,沉淀中除了有脂肪干细胞ASCs,另外还存在部分血细胞、成纤维细胞和内皮细胞,基质血管细胞沉淀后可以接种到塑料培养瓶中,基质细胞可贴壁,造血和其他杂质细胞不贴壁,在随后的传代过程中将会被除去,最终得到的脂肪干细胞ASCs可再很长时间内保持摸分化状态)在体外分离原代细胞。取C57BL/6 WT小鼠2只,常规麻醉消毒,取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状,用PBS液冲洗去麻药及血液,0.075%II型胶原酶消化(37℃,30分钟)以去除外基质,用生理盐水终止胶原酶的消化,离心(1 200 g,10分钟),弃上清液及未消化的脂肪,10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀,再用0.16 mol/L氯化氨溶解剩余的红细胞,离心洗涤,过200目铜网,得到单个核细胞。镜下计数,按104个细胞/ml种植在培养瓶中,37℃ 5%CO2孵箱培养,24小时后第一次换液,之后3天换液一次,80%融合后用0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。显微镜下作形态学观察并选取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期以及细胞免疫表型(CD29/CD44)鉴定。  目前,上海基尔顿生物,主营实验技术服务,如想了解细胞实验的更多内容,欢...
发布时间: 2017 - 06 - 14
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甲基化在研究基因的调控和肿瘤的发生过程中有着非常重要的作用。一般在正常的细胞中,基因调控区CpG均处于非甲基化状态。而当细胞一旦发生癌变后,这些CG区域往往会呈现出甲基化状态。英国医学刊物《the Lancet》曾报道过,奥地利因斯布鲁克医学院的专家们通过检测大便中DNA的甲基化状态变化,将健康人的大便与结肠癌患者的大便区分开来。大便标本中SFRP2 甲基化的程度是诊断结肠癌最可靠的指标。研究人员发现,肿瘤的发生以及一些遗传病的出现和基因甲基化有非常密切的关系。目前DNA甲基化研究是肿瘤分子生物学研究的一个重要分支。    Pyrosequencing技术作为一种新的序列分析技术,能够快速地检测出DNA分子中甲基化的频率,对样品中甲基化位点进行定性及定量检测,可以为甲基化研究提供了新的手段。Pyrosequencing通过合成的方法进行DNA序列DE 分析。它通过核苷酸和模板结合后释放 出的焦磷酸引发酶级联反应,激发荧光素发光。这项技术曾经被用于单核苷酸多态性(SNP)的基因型和单倍型检测,以及细菌和病毒的鉴定和分型研究。这项技术在Pyrogarm™软件上显示的峰值高度均为来自于序列分析的原始数据,通过峰值的高度可以精确的检测出混合DNA模板中等位基因出现的频率。通过Pyrosequcing系统可以获得以下结果:1发生甲基化的DNA序列位点;2 每个位点甲基化程...
发布时间: 2017 - 06 - 14
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