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小鼠肝细胞原代培养实验方法原理将小鼠的肝细胞从机体中取出,经胰酶、螯合剂(常用EDTA)处理,分散成单细胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖。 小鼠肝细胞原代培养实验材料小鼠、试剂、试剂盒    DMEM无血清DMEM培养基胰酶PBS 仪器、耗材 饭盒纱布剪子镊子烧杯平皿研磨玻片滤网离心管6孔培养板吸管移液管手套微量加样器 小鼠肝细胞原代培养实验步骤一、实验材料准备1.动物:小鼠。2.试剂:DMEM(含血清)、无血清DMEM培养基、胰酶、PBS。3.器械:饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管(15/50 ml)、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器。4.准备:酒精擦拭台面后把物品摆放好,开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。二、方法1.将小鼠断颈致死,置75%酒精泡2-3秒钟,取肝脏,置于盛有PBS的平皿中。2.剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物,转移到另一个盛有PBS液的平皿中。3.用手术剪将脏器剪成小块(大小约1mm2),玻片研磨,转到离心管,离心(1 000 rpm,5 min)。4.视组织或细胞量加入5-6倍(3-5 ml)胰酶,37℃中消化20分钟,每隔5分钟振荡一次,或用吸管吹打一次,使细胞分离。5.加入3-5 ml含血清的培养液以中止胰酶消化作用。6.用100...
发布时间: 2017 - 06 - 19
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1.没有得到扩增产物 (1)酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活,往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。 (2)模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸,造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。 (3)变性温度是否准确:PCR仪指示温度与实际温度是否相符,过高酶在前几个循环就迅速失活;过低则模板变性不彻底。(4)反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶,应在未加Taq酶以前,将反应体系95℃加热5-10分钟。 (5)引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化,或因储存条件不当而失活。(6)使用PCR试剂盒时还应注意:①是否严格按照说明书操作;②试剂使用前是否充分混匀;③试剂储存过久或不当而失效。 2.扩增产物在凝胶中涂布或成片状 (1)酶量过高。减少酶量;酶的质量差,调换另一来源的酶。(2)dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。 (3)MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。 (4)循环次数过多;增加模板量减少循环次数,缩短退火时间及延伸时间,或改用二种温度的PCR循环。(5)退火温度过低。 (6)电泳体系有问题:①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大;②凝胶没有凝固好;③琼脂糖质量差。 (7)若为PCR试剂盒则可能:①由于运输储存不当引起试剂盒失效; ②试剂盒本身质量有问题,如引物选择、循环参数等选择不当。 (8)降解的陈旧模板扩...
发布时间: 2017 - 06 - 19
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培养细胞一经污染,多数较难处理。在细胞培养中如果污染细胞价值不大,宜弃之;在寻找原因后彻底消毒操作室,复苏或重新购置细胞,再进行细胞培养。污染细胞价值较大,又难于重新得到,可采取以下办法清除。1、细菌和真菌的清除抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。 预防用药一般用双抗生素,污染后清除用药需采用大于常用量5~10倍的冲洗法,于加药后作用24~48小时,再换常规培养液。此法在污染早期有效。2、支原体的清除(1) 用MRA处理用MRA(Mycoplasma Removal Agent)处理细胞,每4天换一次液,连续处理15天以确保细胞纯洁健康,效果好。   (2) 用清洗纯化法清除支原体污染的方法 细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤。其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的。由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生,所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限。如结合敏感抗生素的抑杀作用,可达到更好的效果。(3) 药物辅助加温处理 细胞培养先用药物处理后,再将污染的组织培养物放在41℃培养18小时,可杀死支原体,但对细胞有不良影响。(4) 使用支原体特异性血清  用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染,因特异抗体可抑制支原体生长,故经抗...
发布时间: 2017 - 06 - 14
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