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培养细胞一经污染,多数较难处理。在细胞培养中如果污染细胞价值不大,宜弃之;在寻找原因后彻底消毒操作室,复苏或重新购置细胞,再进行细胞培养。污染细胞价值较大,又难于重新得到,可采取以下办法清除。1、细菌和真菌的清除抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。 预防用药一般用双抗生素,污染后清除用药需采用大于常用量5~10倍的冲洗法,于加药后作用24~48小时,再换常规培养液。此法在污染早期有效。2、支原体的清除(1) 用MRA处理用MRA(Mycoplasma Removal Agent)处理细胞,每4天换一次液,连续处理15天以确保细胞纯洁健康,效果好。   (2) 用清洗纯化法清除支原体污染的方法 细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤。其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的。由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生,所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限。如结合敏感抗生素的抑杀作用,可达到更好的效果。(3) 药物辅助加温处理 细胞培养先用药物处理后,再将污染的组织培养物放在41℃培养18小时,可杀死支原体,但对细胞有不良影响。(4) 使用支原体特异性血清  用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染,因特异抗体可抑制支原体生长,故经抗...
发布时间: 2017 - 06 - 14
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(一)所谓DNA探针,实际上是指利用一段已知序列的基因片段,与待测样品进行杂交。若靶基因和探针的核苷酸序列互补,就可以按碱基配对的原则进行核酸分子杂交,从而达到检测鉴定样品基因的目的。在随机引物法标记的反应液中,以随机合成的六聚核苷酸作为引物,dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物,单链DNA作为模板,在Klenow酶的作用下,合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后,再通过免疫反应进行检测。通过酶标记地高辛抗体检测,就可以肯定杂交反应存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统,BClP/NBT显色。敏感性很高。可用于膜上杂交和原位杂交。(二)核酸探针膜上杂交原理1、杂交总原则单体脱氧核苷酸通过磷酸二酯键缩合成长链构成DNA一级结构。两条碱基互补的多核苷酸链按碱基配对原则形成双螺旋,构成DNA的二级结构。某些条件(如酸、碱,有机溶剂,加热,射线等)可使氢键断裂,DNA双链打开成单链重新结合。所谓杂交,是具有一定互补序列的核酸单链,DNA单链仍然可与序列同源的单链按碱基互补的原则结合成异源性双链结构的过程。2、杂交膜的选择Southern杂交所用的杂交膜可以选择硝酸纤维素膜和尼龙膜。硝酸纤维素膜的优点在于本底比较低,但只限于显色性检测,且不可重复杂交。尼龙膜分带正电的膜和不带电的膜两种。带正电的膜对核酸结合能力强,敏感性也较高。不...
发布时间: 2017 - 06 - 14
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利用细胞培养技术、流式细胞术(体外扩增后脂肪干细胞ACSs的表型会发生改变,主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化),差异离心术(可将基质血管细胞沉淀并与悬浮的成熟脂肪细胞分离开来,沉淀中除了有脂肪干细胞ASCs,另外还存在部分血细胞、成纤维细胞和内皮细胞,基质血管细胞沉淀后可以接种到塑料培养瓶中,基质细胞可贴壁,造血和其他杂质细胞不贴壁,在随后的传代过程中将会被除去,最终得到的脂肪干细胞ASCs可再很长时间内保持摸分化状态)在体外分离原代细胞。取C57BL/6 WT小鼠2只,常规麻醉消毒,取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状,用PBS液冲洗去麻药及血液,0.075%II型胶原酶消化(37℃,30分钟)以去除外基质,用生理盐水终止胶原酶的消化,离心(1 200 g,10分钟),弃上清液及未消化的脂肪,10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀,再用0.16 mol/L氯化氨溶解剩余的红细胞,离心洗涤,过200目铜网,得到单个核细胞。镜下计数,按104个细胞/ml种植在培养瓶中,37℃ 5%CO2孵箱培养,24小时后第一次换液,之后3天换液一次,80%融合后用0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。显微镜下作形态学观察并选取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期以及细胞免疫表型(CD29/CD44)鉴定。  目前,上海基尔顿生物,主营实验技术服务,如想了解细胞实验的更多内容,欢...
发布时间: 2017 - 06 - 14
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