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1、冰冻切片制备:建议用新鲜组织,否则组织细胞内部结构破坏,易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等,防止裂片和脱片严重。2、组织切片固定:切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min,尤其要较长时间保存的白片,一定要及时固定和适当保存。3、血清封闭:为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合,需要在一抗孵育前先用血清(与二抗来源一致)封闭,减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的,一般10-30min。4、一抗孵育条件:在免疫组化反应中最重要,包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种:4度、室温、37度,其中4度效果最佳;孵育时间:这与温度、抗体浓度有关,一般37度1-2h,而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。5、二抗孵育条件:二抗一般室温或37度30min-1h,具体时间需要摸索,而浓度一般有工作液,若是浓缩液还要摸索浓度,切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下,然后去摸索一抗浓度和孵育时间。最后,荧光素标记的二抗随着保存时间的延长,可能后有大量的游离荧光素残留,需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。6、复染:目的是形成细胞轮廓,从而更好地对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。7、免疫荧光中封片:为了长期保存,我们一般用缓冲甘油等封片,此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡,方法是直接在载玻片...
发布时间: 2017 - 06 - 21
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在细胞凋亡过程中中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂都会产生大量的粘性3'-OH末端,在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,可将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端,通过这种方法可进行对凋亡细胞的检测,我们称这类方法为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。由于正常的或正在增殖的细胞几乎不存在DNA双链或单链的断裂,因而极少有3'-OH的存在,所以很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。TUNEL法原位标记凋亡检测试剂盒细胞发生凋亡以后,出现多个生物学改变特征,如:细胞膜、染色质凝集、核DNA断裂等等。目前DNA断裂检测是一种被广为认可的检测细胞凋亡的方法,这种检测可以通过提取细胞DNA进行凝胶电泳来完成,也可以进行原位检测。TUNEL方法的基本原理如下:在TdT酶作用下,将生物素或者溴标记的核苷酸连接到细...
发布时间: 2017 - 06 - 21
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捕获测序一种是随着高通量测序技术的应用而产生的序列捕获技术。研究者将捕获的目标序列分为外显子组测序和靶向捕获测序。外显子组捕获测序:通过外显子组测序来定位与蛋白质功能变异相关的基因变异。与全基因组测序相比,外显子组测序更加的经济和高效。靶向捕获测序:靶向捕获测序又称为目标区域测序,是对研究者感兴趣的蛋白编码区域DNA或某段特定序列进行捕获,富集后进行高通量测序。通过目标区域测序,可以定位与特定性状相关的候选基因。靶向捕获测序根据所使用的捕获技术的不同,又可以分成两大类:扩增子测序:使用PCR的手段对目标片段进行扩增,然后对扩增产物再进行深度测序。扩增测序的捕获产品有Qiagen和Illumina TruSeq Amplicon panel。基于芯片杂交的捕获测序:通过定制针对目标基因组区域的探针,与基因组DNA进行杂交,将获得的目标区域DNA富集后再进行高通量测序。捕获平台包括:Agilent SureSelect平台、Roche NimbleGen平台。 根据每个客户的研究目标和内容灵活定制研究方案1.探针设计完全自由,物种和区域大小没有绝对限制,只需提供目标区域相关信息和参考基2.因组信息3.探针长度超过100 bp,对于片段缺失的容错率可达25 bp,有效捕获目标片段4.提供多种预设探针方案,如全外显子、UTR等5.提供标准和高级生物信息分析,可根据客户需求提供个性...
发布时间: 2017 - 06 - 20
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