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一、试剂耗材:   小鼠(8-10周龄)、玻璃皿(用于解剖小鼠)、培养皿(塑料,DC在光滑的皿里转化的好,因此最好使用一次性的塑料培养皿)、剪刀、镊子、纱布、细胞培养液、GKN缓冲液、吸管、离心管(50ml、100ml用饭盒多装一些)、锡箔纸、1ml注射器。    细胞因子:GM-CSF、IL-4    高压灭菌:除锡箔纸、注射器,其他物品都需要高压灭菌。  二、实验步骤: 1.取下小鼠的四肢(后两肢最好),分离骨上附着的肌肉、血管、皮肤(用纱布反复的搓),完全暴露出骨及其附带关节,注意不要离断关节。将腿骨剪成三节即小腿骨、关节处、大腿骨; 2.用1ml注射器吸取GKN(1640也可以,但费用较高),冲洗骨髓至骨完全变白,吹入两个离心管,便于离心找平; 3.1000转5分钟离心,倒掉上清液,再用1640悬起再离心一次,倒掉上清液;4.加细胞培养液,将骨髓细胞重悬,一只小鼠大概分4个培养皿,重悬的细胞总量尽量保持4ml;5.细胞至于培养皿,补充培养基。即1ml细胞+4ml培养液;6.加入细胞因子,IL-4和GM-CSF以向DC转化。用锡箔纸包裹,避光放入培养箱,轻拿轻放不可摇晃; 7.第三天(之前不可拿出)等量加入培养基即4ml,并加入对应量的细...
发布时间: 2019 - 07 - 09
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悬浮细胞的siRNA转染操作步骤,以24孔板siRNA转染为例1.提前1天细胞种植悬浮细胞:采用对数生长期的细胞,数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105,那么就用2×105的细胞进行转染。2.转染过程取0.67ug(50pmol)的siRNA,加入一定量无血清稀释液,充分混匀,制成RNA稀释液,终体积为25μl。注意:无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。取1ul的EntransterTM-R4000,然后加入24ul无血清稀释液体,充分混匀,制成EntransterTM-R4000稀释液,终体积为25μl。室温静置5分钟。将EntransterTM-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合(可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上)混合,室温静置15分钟。转染复合物制备完成。将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基(可含10%血清和抗生素)的细胞上,前后移动培养皿,混合均匀。注意:对本试剂,采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。转染后6小时观察细胞状态,如状态良好可不必更换培养基,继续培养24-96小时得到结果。注意:1.siRNA转染后,继续培养24-72小时在mRNA水平得到结果,继续培养24-96小时在蛋白水平得到结果。mRNA转染后,根据需要在24小时后得到结果。2.在部分实验室,...
发布时间: 2019 - 07 - 04
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阿尔茨海默病(AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。以往使用C57BL/6J (“B6”)小鼠制备基因修饰模型,为阐明基因功能做出了重大贡献。但是对于阿尔茨海默氏病这种慢性复杂性疾病,纯系小鼠不是很好的模型,这可能导致无法将研究结果从小鼠转化到临床的原因之一。野生小鼠品系表现更多的遗传多样性,所以能更好的模拟在阿尔茨海默氏症基因效应,可以成为与人类相似的多样性更好的模型。美国杰克逊实验室(JAX)副教授Gareth Howell团队在PLOS Genetics报道,将阿尔茨海默病相关基因广泛使用的APPswe和PS1de9 (APP/PS1) B6小鼠,与三种野生小鼠品系CAST/EiJ、WSB/EiJ和PWK/PhJ进行杂交制备了新的转基因鼠。这些野生小鼠背景的模型可以表现出阿尔茨海默氏症基因和生理相关的风险因素的变异,与人类患者群体表现相似。携带早发性阿尔茨海默氏症突变的野生小鼠,在认知能力、神经退行性变和斑块负荷在内的一系列阿尔茨海默氏症特征性表型,表现出品系、性别和基因型的差异。另外还观察到伴有血管渗漏脑淀粉样血管病,提示其中一个品系可能是一种新的混合病理模型。进一步分析发现,与阿尔茨海默氏病易感性相关的大脑免疫反应相关的基因在不同的野生小鼠品系中的表达也有显著不同。野生型小鼠在髓系细胞(对斑块起反应的免疫细胞)的表达和数量上表现出特异性的差异。在阿尔茨海默...
发布时间: 2019 - 07 - 04
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