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细胞传代培养原理细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时也将细胞数量扩大,就必须进行传代(再培养)。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以,而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。二、材料和试剂1、细胞:贴壁细胞株2、试剂:0.25%胰酶、1640培养基(含10%小牛血清)3、仪器和器材:倒置显微镜,培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等三、操作步骤1、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。2、加入0.5—1ml 0.25%胰酶溶液,使瓶底细胞都浸入溶液中。3、瓶口塞好橡皮塞,放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移,原贴壁的细胞逐渐趋于圆形,在还未漂起时将胰酶弃去,加入10ml培养液终止消化。观察消化也可以用肉眼,当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1—3分钟。4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液,分到另外两到三瓶中,实践培养液塞好橡皮塞,置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。附:消化液配制方法:称取0.25克胰酶蛋白酶(活力为1:250),加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s液溶解,滤器过滤除菌,4℃保存,用前可在37℃下回温。胰酶溶液中也可加入EDTA,使最终浓度达0.02%。无菌操作的注意事项:细胞原代培养一定要保持工作区的无菌清洁,先用紫外灯杀菌1h,操作前用...
发布时间: 2019 - 07 - 10
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一、试剂耗材:   小鼠(8-10周龄)、玻璃皿(用于解剖小鼠)、培养皿(塑料,DC在光滑的皿里转化的好,因此最好使用一次性的塑料培养皿)、剪刀、镊子、纱布、细胞培养液、GKN缓冲液、吸管、离心管(50ml、100ml用饭盒多装一些)、锡箔纸、1ml注射器。    细胞因子:GM-CSF、IL-4    高压灭菌:除锡箔纸、注射器,其他物品都需要高压灭菌。  二、实验步骤: 1.取下小鼠的四肢(后两肢最好),分离骨上附着的肌肉、血管、皮肤(用纱布反复的搓),完全暴露出骨及其附带关节,注意不要离断关节。将腿骨剪成三节即小腿骨、关节处、大腿骨; 2.用1ml注射器吸取GKN(1640也可以,但费用较高),冲洗骨髓至骨完全变白,吹入两个离心管,便于离心找平; 3.1000转5分钟离心,倒掉上清液,再用1640悬起再离心一次,倒掉上清液;4.加细胞培养液,将骨髓细胞重悬,一只小鼠大概分4个培养皿,重悬的细胞总量尽量保持4ml;5.细胞至于培养皿,补充培养基。即1ml细胞+4ml培养液;6.加入细胞因子,IL-4和GM-CSF以向DC转化。用锡箔纸包裹,避光放入培养箱,轻拿轻放不可摇晃; 7.第三天(之前不可拿出)等量加入培养基即4ml,并加入对应量的细...
发布时间: 2019 - 07 - 09
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悬浮细胞的siRNA转染操作步骤,以24孔板siRNA转染为例1.提前1天细胞种植悬浮细胞:采用对数生长期的细胞,数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105,那么就用2×105的细胞进行转染。2.转染过程取0.67ug(50pmol)的siRNA,加入一定量无血清稀释液,充分混匀,制成RNA稀释液,终体积为25μl。注意:无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。取1ul的EntransterTM-R4000,然后加入24ul无血清稀释液体,充分混匀,制成EntransterTM-R4000稀释液,终体积为25μl。室温静置5分钟。将EntransterTM-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合(可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上)混合,室温静置15分钟。转染复合物制备完成。将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基(可含10%血清和抗生素)的细胞上,前后移动培养皿,混合均匀。注意:对本试剂,采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。转染后6小时观察细胞状态,如状态良好可不必更换培养基,继续培养24-96小时得到结果。注意:1.siRNA转染后,继续培养24-72小时在mRNA水平得到结果,继续培养24-96小时在蛋白水平得到结果。mRNA转染后,根据需要在24小时后得到结果。2.在部分实验室,...
发布时间: 2019 - 07 - 04
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